无需暗室的荧光显微成像系统让研究发生了巨变

佐谷 秀行 教授

庆应义塾大学 医学部教授
尖端医科学研究所 基因控制研究部门 医学博士

生于1956年。87年完成神户大学研究生院医学研究科博士课程。87年获得医学博士学位后,担任加利福尼亚大学旧金山分校脑肿瘤研究中心研究员,随后在88年和94年先后任职德克萨斯大学M.D.安德森癌症中心助理教授和熊本大学医学部的肿瘤医学讲座教授。2007年出任庆应义塾大学医学部附属尖端医科学研究所教授。专攻肿瘤生物学。迄今为止,已经获得了星野纪念学者奖(2000年)、卡哈特纪念学者奖(2000年)、狄波拉瑞切曼纪念学者奖(2001年)等诸多殊荣。

利用人工癌症干细胞,解读癌症发生及转移的机理,旨在为创药奠定坚实的基础

庆应义塾大学医学部尖端医科学研究所的基因控制研究部门将癌症发病与恶性化的分子机构作为主题,致力于研究先进的癌症治疗方法。作为该部门的首任教授,佐谷秀行先生希望将最尖端的基础研究成果及技术运用到临床医学当中为以癌症为代表的各类疑难杂症的预防、诊断及治疗提供助力。他借助以分子靶向为中心的生物学手段,在以脑肿瘤为代表的癌症治疗基础研究中投入了大量的精力。

01. 聚焦癌症干细胞,解读癌症的机制构架

癌症是在有分裂能力的细胞中,因受到癌症抑制基因或癌症基因变异造成细胞中的基因丧失稳定性,最终引发增殖停止、细胞死亡、老化等问题,细胞机构出现异常,进而导致癌症的发生。

过去研究者们一直认为癌症组织就是不停持续增殖的细胞团块,而近年来的研究则发现,癌细胞其实可分为2种类型。一种是具备自我复制功能,能够半永久持续增殖的细胞,也就是“癌症干细胞”。另一种最终会丧失增殖功能,且占总体癌细胞的大多数。换言之,现已逐渐发现正常干细胞与前体细胞之间的关系,同样存在于癌细胞当中。

癌症干细胞的特性之一,就是细胞周期较长,对抗癌剂及放射线照射的感受性较低,难以进行治疗。因此,药剂治疗等手段虽然能够杀死大多数的癌细胞,却无法消灭癌症干细胞。这直接关系到癌症难以得到根治的关键问题。

为了解决这一问题,庆应义塾大学医学部教授佐谷秀行先生利用细胞生物学手段深入分析细胞周期控制机构及细胞粘附控制机构等,利用动物模型验证相关结果,积极致力于从分子水平上研究剖析癌症发生、浸润及转移的机理。

02. 探究基于分子靶向理念的治疗方法

从神户大学医学部毕业后,佐谷先生立志要成为一名治疗脑肿瘤的脑神经外科临床医师。但残酷的现实却给了他当头一棒,在罹患恶性脑肿瘤的患者当中,有95%的人会在2年内离世。由于现有的药物及手术治疗手段有限,他为了自行探究治疗方法,选择进入研究生院从事研究工作。但是,“在研究生院的学习虽然让我获得了博士学位,在治疗方法方面还是毫无头绪”,让他明白了攻克脑肿瘤依旧是任重而道远。

1987年完成研究生院的博士课程后,佐谷先生前往美国加利福尼亚大学旧金山分校的脑肿瘤研究中心,开始了留学生涯。当时该中心研究世界最先进的癌症治疗法,前往该中心或许能够掌握最新的知识。在此期间,佐谷先生潜心从事脑肿瘤的基因分析,全力探索被视为治疗关键的靶向分子。“分子靶向”的概念在当时还是非常先进的,为此后的研究提供了关键性线索。

次年,佐谷先生又出任了德克萨斯大学M.D.安德森癌症研究中心神经肿瘤部门的助理教授。进入这家全美最大的癌症治疗机构后,佐谷先生先后参与了以脑肿瘤为主的多种部位的癌症研究。

在其后的94年,熊本大学开设了肿瘤医学讲座,专业讲解肿瘤的基础研究知识,佐谷先生被聘任为首任教授。

在那里,他首先开展的就是以脑肿瘤为首的各类癌细胞周期的相关研究。所谓细胞周期,就是从上一代细胞分裂产生新生细胞,到新生细胞变为母细胞并再次分裂产生下一代细胞的过程。佐谷先生认为,探明癌细胞周期的机理,或许就能找到阻断癌细胞增殖的突破口。为此,佐谷先生迅速地将延时拍摄运用到了细胞分裂情况的观察中,开展了全面深入的基础研究。之所以采用这种研究方法,是因为在美国留学期间,他亲眼目睹了许多“脱离基础研究的纯应用创药研究,注定会功亏一篑。”的案例。

03. 以细胞为基础的药剂筛选

佐谷先生不仅在上述关注细胞分裂期机理的创药研究领域做出了杰出贡献,在细胞粘附分子CD44的研究领域也颇有名望。CD44是一种粘合细胞的分子,根据佐谷先生的研究,这或许是肿瘤转移过程中的关键分子。通过控制这种分子,或许可以阻断癌细胞的浸润及转移。

作为世界范围内癌症研究的杰出人物,佐谷先生同时开展着两项研究,而他的目标,就是研制出能够有效治疗脑肿瘤等难治性癌症的分子靶向药。这一领域的研究正在全球范围内逐步推进,但还没有任何一家研究机构建立起能够以接近于生物体的条件测试药剂效果的系统。“借助实验室培养的肿瘤细胞株,用in vitro*进行实验虽然能够了解其有效性,但目前的研究难题,是如何判断新药对人体是否真正有效。只要攻克了这一难题,就能一鼓作气地开始向创药筛选发起冲刺。”

但是,用生物模拟模型开展研究并非易事。简单地来说,细胞培养板是二维环境,而生物体则是三维环境。后者之中还混合了各类复杂的结构,癌细胞可以找到许多藏身之处,因此药剂对不同部位的效果存在差异。如何解决这种“不均一性”问题,就是研究所面临的巨大难题。换言之,研究的关键,就是如何利用细胞和in vitro再现接近于生物体的环境。

一直以来,我们在研制某种酶的抑制剂时,通常都会单独将酶加入试管,进行筛选。佐谷先生的研究室则另辟蹊径,选择以细胞为基础单位,测试药剂的效果。这种方法用在特殊条件下培养的细胞再现生物体发生的病理状态,再对化合物引发的变化进行观察。近年来,以佐谷先生的创新举措为代表,创药的方式正在发生翻天覆地的变化。佐谷先生指出,如今“以酶为基础的药剂筛选模式,正在逐渐转变为以细胞为基础的模式”。

* in vitro:试管内的实验环境。与之相对的概念是in vivo(生物内的环境)。

04. 成功制造人工癌症干细胞(iCSC)

佐谷先生正在开展的新研究,是科学技术振兴机构战略性创造研究推进事业(CREST)采纳的“人工癌症干细胞分化控制异常分析与癌症创药研究”。佐谷先生应用iPS细胞的制造技术,对小鼠的正常细胞实施了特定的基因操作,成功地将其诱导成了具有自我复制、分化及肿瘤形成能力的人工癌症干细胞(induced cancer stem cell:iCSC)。

今后他还将采用各类iCSC,在探究肿瘤形成的机构的同时,筛选能够控制肿瘤形成的化合物、抗体等。虽然目前正在利用小鼠进行研究,但为了将其用作癌症治疗创药的靶向因子,最终还是需要利用人类正常体细胞制造iCSC。

在基于癌症干细胞理论的新研究中,研究者们正在考虑采用分别针对子代癌细胞与癌症干细胞发挥作用的药剂。这种治疗法先用治疗药杀死子代癌细胞,再用其他药物针对性地消灭传统治疗药难以奏效的癌症干细胞。这样一来,或许就能急剧提升治疗效果。

05. 无需暗室的荧光显微成像系统让研究发生了巨变

佐谷先生表示,目前的癌症治疗重视细胞级别的研究,“图像观察备受重视,显微镜正在发挥越来越重要的作用”。“要详细观察癌细胞的变化,必须借助立体观察。不仅要进行观察,还必须通过癌细胞计数来了解不均一性。为此,我们需要一种能够在快速完成观察作业的同时进行测量的显微镜。”

佐谷先生自学生时代起就始终致力于细胞级别的研究,荧光显微镜是他开展研究时的必需设备。谈及当时的辛劳,佐谷先生仍然记忆犹新:“我几乎每天都要在暗室里呆至少3小时进行观察。在绘制细胞图像时,还必须同时用手电筒照亮眼前。这种作业方式不仅会造成视疲劳,效率也很差”。

因此,当他在熊本大学任职期间首次在演示活动中见到基恩士的“BZ系列”荧光显微成像系统时,他非常惊讶。“能够不借助目镜,而是直接用显示器进行观察,简直就是一项划时代的变革。由于学生们对使用BZ系列的呼声很高,我便决定引进这款设备。”

图片:安装在佐谷研究室内的……
安装在佐谷研究室内的BZ系列显微镜。采用节省空间的设计,具有不占空间的优点。

引进后的效果可谓是立竿见影。“因为能够在明亮的环境下使用,观察起来更加轻松。此外,还能和大批学生一起观察显示器上的影像,实时说明重要位置,提出实验相关的指示,这些都是这款产品的巨大优势。使用目镜观察的显微镜根本就不可能做到这些”,佐谷先生这样说道。

虽然近年来,创药筛选出现了预先粗筛化合物的倾向,但备选化合物的数量达数千到一万左右,高效筛选仍然是不可或缺的作业关键。可以说,能否快速完成观察及拍摄操作,完全取决于显微镜的好坏。

注重教育现场信息共享的佐谷先生还会特意在显示器画面上展示显微镜拍摄到的清晰细胞图像等。这样一来,研究室的学生就会通过画面涌现兴趣,跃跃欲试地希望“自己也能拍摄出清晰的图像”。佐谷先生表示,“我认为通过图像共享研究成果,有助于提高研究室的整体水平”。

06. 为研究高效化做出贡献的BZ系列

佐谷先生选择研究设备时的重要标准,就是“能否提高科研速度”。除此之外,研究室内有多少研究员会用想用,也是他考量的关键。“从这一点来看,研究室内几乎所有的研究员都在使用BZ系列。而且虽然使用率很高,却并未发生过故障,这一点也值得称赞”。

要在细胞级别上了解小鼠的癌细胞浸润及转移情况,需要对脏器的连续切片进行观察。单个脏器就要制作20至30枚切片标本,“如果使用传统的目镜显微镜,根本无法在短时间内完成观察”。而使用BZ系列进行观察,只需1小时左右就能完成拍摄。

图片:脏器的连续切片标本……
脏器的连续切片标本。这么大的拍摄量1小时左右就能处理完毕。

在拍摄广域图像后也能快速拼接图像并消除接缝的“图像拼接”功能,同样深受佐谷先生的好评。“在学会上发表图像时,出席的老师们经常会就拍摄方法提出问题”。

要详细了解癌细胞的增殖情况,就需要在更接近生物体的环境下进行立体观察,此时,擅长进行纵向观察的“XY/Z轴载物台”能够发挥一定的作用。

除此之外,要测量一定密度下的癌细胞数量,经常还会用到“细胞计数”功能。在要求用数值量化观察内容的时代,这项功能的重要性正在与日俱增。

图片:BZ系列拼接后得到的小鼠……
BZ系列拼接后得到的小鼠胃部广域图像。彻底消除了接缝、不均之类的问题。脏器尺寸约为18 × 12 mm。
图片:BZ系列“图像拼接”的……
BZ系列“图像拼接”的操作画面。通过简单操作就能拼接多张图像。

07. 借助“去霾处理”功能获得清晰的图像

在佐谷研究室中,共同研究员石本崇胤先生经常会使用BZ系列。目前他正在从事胃癌发病机理的相关研究。近年来的研究已经发现,幽门螺杆菌与胃癌的发生存在关联性,但利用in vivo并不能彻底探明其中的机理。石本先生正在尝试利用转基因小鼠开展研究,从分子水平上查明胃癌发生的机理。

图片:石本先生
“轻松操作就能拍摄清晰图像”,在评价BZ系列时,石本先生这样说道。

他将BZ系列用于小鼠胃部的整体图像及切片观察。
“过去,用荧光显微镜观察组织切片并非易事,我们无法轻易地使用这种方法。首先,要用荧光显微镜进行观察,就必须先带着装有样本的标本,抓紧时间赶往位于其他楼栋中的暗室。这是一件相当麻烦的事情。相比之下,BZ系列则能够直接安装在研究室内,随时都能使用,真的是难能可贵。”

在实验较为集中的阶段,石本先生几乎每天都会使用BZ系列。
“不管怎么说,清晰的图像就是这款产品的魅力。能够消除荧光模糊的‘去霾处理’功能也是我本人非常喜欢的功能。这项功能能够让我明确掌握关键细胞的表达情况,拍摄出富有说服力的图像。”

图片:胃的荧光放大图像。用“去霾处理”功能处理前……
胃的荧光放大图像。用“去霾处理”功能处理前。绿色部分是慢性炎症的结果——发生上皮化生的胃黏膜上皮。红色部分则是上皮分泌的粘液。
图片:用“去霾处理”功能处理上图后得到的图像……
用“去霾处理”功能处理上图后得到的图像。消除了荧光模糊,得到清晰的图像。

08. 论文用图像全部用BZ系列拍摄

石本先生还表示,BZ系列在提高研究效率方面也起到了不小的作用。“在对目标细胞进行计数时,我会采用‘细胞计数’功能。不仅计数速度快,结果也很准确,真是方便好用。过去我一直要握着计数器对逐个细胞进行手动计数,动辄就要耗费半天的时间。BZ系列的细胞计数则能在短时间内完成这项作业。”

图片:正在胃组织上增殖的癌细胞……
正在胃组织上增殖的癌细胞。使用细胞计数功能前的原图像。
图片:执行细胞计数功能后的图像……
执行细胞计数功能后的图像。可以用绿色进行标记,自动完成计数

除此之外,软件操作简单也是BZ系列的一大魅力,研究室内的人员都能通过直观操作顺利使用。

虽然研究所内还安装了共焦显微镜,但自从引进BZ系列以来,就几乎没有人再去使用了。“共焦显微镜是我们所内的公用设备,必须提前预约,不能随时使用。相比之下,BZ系列就安装在我们身边,随时都能自由使用。而且开展研究所必需的观察、拍摄、细胞计数作业都能被BZ系列一机包办,真的是非常便利”,石本先生对BZ系列赞不绝口道。

眼下,石本先生正在整理学会发表用的论文。发表时使用的所有图像都是用BZ系列拍摄的。

“以胃癌为代表的消化器官癌症的发病机理尚不明确。而乳腺癌、白血病等疾病的发病机理分析工作正在逐步推进当中。我希望查明消化器官癌症的发生机制,为癌症治疗研究贡献力量。”

09. 大幅改变癌症治疗理念的可能性

图片:佐谷先生
佐谷先生提出了自己的理想:“以积累至今的基础研究成果为基石,努力创制新药,为社会贡献力量”。

佐谷先生正在利用iCSC开展针对细胞的研究工作,这种方法在今后或许会成为癌症创药筛选的常规方法。不光能用来攻克癌症,或许还能被用于遗传性疾病及代谢性疾病的相关领域。

而他最大的理想,就是研究出针对脑肿瘤等难治性癌症的治疗法。“我希望能够为全世界的任何地方都能拥有相同的药剂治疗的坚实基础作出贡献。我的梦想,就是竭尽全力让能够有效治疗脑肿瘤的口服药早日面世”。

随着今后利用iCSC的先进研究不断推进,研究者们将彻底查明癌症发生的机理,癌症治疗的手段也会迎来巨变。或许终有一天,目前死因第一名的癌症,将不再被视为“绝症”。

(截至2009年3月)

<小知识> 人工癌症干细胞(iCSC)

运用iPS细胞的制造技术,人工制造的癌症干细胞。对小鼠的骨髓造血系统细胞及骨髓间质细胞实施基因操作,可以制造出引发恶性肿瘤的人工癌症干细胞(iCSC=induced cancer stem cell)。人工癌症干细胞应该能够为癌症治疗用药物的研制提供极大的帮助。此外,在推进iPS细胞的临床应用时,研究癌变机构同样是一个难题,iCSC或许还能帮助我们解决这个问题。