帮助脑研究团队观察标本的BZ系列

森下 龙一 教授

大阪大学研究生院 医学系研究科 临床基因治疗学
教授 医学博士

生于1962年。1987年毕业于大阪大学医学部。1991至94年任美国斯坦福大学循环系统科研究员。后任大阪大学助理教授,从事研究生院医学系研究科基因治疗学工作,2003年起担任现职。1999年创办了以创药为目的的风险企业MedGene(现AnGes MG公司)。目前,他还兼任知识产权战略总部成员、经济产业省结构改革审议会知识产权部门委员、文部科学省学术科学技术及学术政策审议会委员等职务。曾获得“Harry Goldblatt奖(美国高血压评议会)”、“日本医师会研究奖励奖”、“日本循环系统学会佐藤奖”等众多荣誉。

领先于世界范围内的水平:开发治疗疑难疾病的基因治疗方法。

大阪大学研究生院医学系研究科的森下龙一教授,开展的基因治疗实用化研究已达到世界范围内的领先水平。他在2003年创建了临床基因治疗研究室,全面开展从基础研究到创药、临床治疗的一系列转化研究。2008年3月,他通过创药风险公司,向厚生劳动省提交了用于末梢性血管疾病治疗的基因治疗药的审批申请,诸如此类的成绩还有许多。目前,面向生活习惯病、免疫疾病、癌症、遗传病等难治性疾病的治疗研究正在逐步走上正轨。

01. 申请审批HGF基因治疗药

基因治疗是一种通过将正常基因导入体内来起到疾病治疗作用的疗法。自1990年美国在全球率先使用这种技术以来,已经经历了无数次的临床试验。日本则在美国的5年之后启动了临床试验。

最初这种疗法主要针对的是先天性疾病的治疗,而近年来,传染病、癌症等后天性疾病也成为了治疗对象,甚至已经开始逐步用于生活习惯病的治疗。

目前,血管新生领域的基因治疗因为颇具发展前景而备受关注。目前在该领域开展全球先驱性研究的,正是大阪大学研究生院医学系研究科的森下龙一教授。他创建了临床基因治疗研究室,全面开展从基础研究到临床应用的转化研究*

1999年,大阪大学在金田安史教授的倡导下开设了基因治疗学讲座,至今已经在基础研究领域产出了大量的研究成果。森下先生的临床基因治疗讲座则致力于将这些成果运用到临床治疗阶段,为备受疾病折磨的广大患者提供有效的医疗救治。

目前正在大步迈向实用化的,是用于治疗闭塞性动脉硬化症等末梢性血管疾病的HGF*(hepatocyte growth factor=肝细胞生长因子)基因治疗临床研究。

末梢性血管疾病,是一种因四肢末梢血管闭塞,导致肌肉等陷入缺血状态,进而引发麻痹、疼痛、下肢溃疡等症状的疾病。仅在日本国内,该病的患者数就有约10万人,在美国则达到了上百万人。

针对这种疾病,森下先生的研究室正在开展临床研究,希望通过将具有细胞及脏器再生作用的HGF注入到缺血部位,帮助血管新生,减轻缺血症状。因临床试验效果优异,2008年3月,HGF基因治疗药通过已经在东京证券交易所玛札兹市场上市的医药类风险企业、AnGes MG株式会社,向厚生劳动省提交了审批申请。如果能够通过审查,这款药物就将成为发达国家研发面世的首款基因治疗药。

* 转化研究
对基础研究成果进行“翻译转化”,将其运用到临床治疗的研究工作。在将大学的研究成果用于创药的过程中,转化研究就显得尤为重要。在新药研发成本逐年递增的背景下,各大院校与创药风险企业及制药企业的协作已成为必然的趋势。

* 肝细胞生长因子(HGF = hepatocyte growth factor)
一种肝脏细胞的生长因子,1980年代在日本被发现。随后,研究者发现其对肝细胞以外的细胞及脏器同样具有再生作用。学术界正在考虑将HGF运用到包括肝脏在内的心脏、血管、脑、肾脏、消化器官、肺、神经等各类疾病的临床治疗当中。目前已开始推进研究的,是在血管及心脏动脉硬化性疾病方面的应用。HGF具有再生血管的作用,有望能够对闭塞性动脉硬化症、血栓闭塞性脉管炎、心绞痛、心肌梗塞等虚血性疾病起到一定的治疗效果。

02. 发展临床研究,用Decoy核酸医药创制药物支架

除了HGF之外,森下先生正在同时开展与血管疾病相关的,Decoy核酸医药(双链寡聚核苷酸)的临床研究。在闭塞性动脉硬化症、心绞痛、心肌梗塞的治疗当中,经常会用带有气囊的导管(细长的医疗管)扩张变窄的血管,起到治疗作用,有时还需要安装金属支架(网眼状的金属筒)进行治疗。但在部分患者身上,可能会出现用气囊扩张过的血管再次变窄的情况,即再狭窄的问题。

为了解决这一问题,森下先生正在开发利用Decoy核酸预防气囊疗法后再狭窄的方法。这种方法被称为药物支架,在气囊导管的顶端涂抹双链寡聚核苷酸,导入到发生狭窄的患部,对引发再狭窄的各类基因的活性化起到抑制作用。

目前这种方法已经在动物实验中获得了很好的效果。如果能够实现这种治疗法,将会大幅减轻再狭窄问题对患者造成的肉体及经济负担。

* 核酸医药
将属于基因成分的核酸(DNA及RNA)用作医药品。Decoy核酸(双链寡聚核苷酸)就是其中之一。虽然Decoy核酸本身并不是基因,却具有控制基因表达的效果。森下先生的研究室正在开展2种血管再狭窄预防用Decoy核酸的研究,分别是E2F Decoy核酸和NFkB Decoy核酸。

03. 从血管新生扩展到神经功能再生的研究主题

除了上述两项即将进入临床阶段的研究外,森下先生的研究室还向新时代的血管新生治疗发起了挑战。这些研究都蕴藏着基因治疗的全新可能性。

其中之一,就是将名为抗菌肽*的血管内皮生长因子用于末梢动脉疾病分子治疗的研究。通过分子筛选,研究人员成功辨识出了一种名为“AG-30”的肽,发现其具有血管新生作用。这种肽不仅具有血管新生效果,还对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌等起到抗菌作用,相信能够为血管新生提供更加安全有效的治疗方法。

而在HGF治疗方面,展望未来的先驱性研究也正在起步。在传统血管新生效果的基础上,又新增了名为神经功能再生的划时代主题。既然已经发现HGF具有伸长神经细胞突起的作用,它或许还可以被用来重新构建因疾病而受损的神经回路,甚至还能在记忆力改善方面发挥功效。该研究成果有望对阿尔兹海默病的治疗起到关键作用。

“一直以来,我始终致力于研究血管动脉硬化等传统生活习惯病的治疗法,阿尔兹海默病其实也能被视为一种生活习惯病,将其归为血管病,就找到了进行治疗的全新可能性。我的研究室正在向这种前所未有的治疗法研究发起挑战。”

从下肢末梢性血管,延伸到心脏乃至大脑,HGF治疗的适用范围正在不断扩展。较过去更具优势的替代疗法,正在这一系列研究的推动下离我们越来越近。

* 抗菌肽
存在于生物体内的免疫功能可分为自然免疫与获得性免疫两种,抗菌肽属于自然免疫。不仅具有良好的抗菌作用,还不易产生耐性菌,近年来正受到越来越多的关注。

04. 为创药积极改革大学研究

森下先生希望通过基因治疗领域的多项先进举措,实现研究成果的实用化。作为一位引领时代的研究者,他的内心其实还有另一个愿望,那就是变革从基础研究通往临床研究的转化模式。他最强调的,就是大学在新时代肩负的使命。

“纵观医疗技术,依靠传统手段发展的空间即将耗尽。包括创药模式在内的方方面面都亟待革新。但是制药企业已经过度适应于传统的创药模式,脱离既成概念将是一个痛苦且漫长的过程。相比之下,大学虽然在基础研究方面硕果累累,却无法彻底延展出创药功能,面临着大量技术无法实用化的现状。要打破这种僵局,大学就必须发挥越来越关键的作用,开展更加富有战略性的研究工作。”

要改变大学的研究模式,森下先生认为必须为研究方法及组织体制等“创建新的机制架构”。还必须让研究员革新理念。研究的关键,是研究速度和效率。森下先生表示,“要让创新取得成功,就必须以全球最快的速度拿出成果,证明这项举措的价值,我们的研究就是与时间的赛跑”。因此,在他的研究室中,“时间=经济价值”的理念已经深入人心。

图片:森下先生
森下龙一先生认为“要让创新取得成功,就必须以最快的速度拿出成果,所以研究的速度很重要”。

而在培养研究员方面,森下先生也谈到要顺应时代变化。

“大学固然是教授尖端技术的课堂,但在日新月异的新时代,所谓的尖端顶多也只能保留半年的先进性。任何技术都会以飞快的速度化为腐朽,光教技术就行的时代早已离我们而去。”

因此,森下先生在指导学生时,会将主要力量倾注在项目管理能力方面。从研究目标设定到研究过程中的方式方法,他都会向研究室的研究生们热心解说。“只有拿出研究成果并赢得外界的好评,研究者才有资格进入下一阶段。就算是从争取更富有竞争力的科研经费来看,也要努力教会学生正确的目标设定方法与达成目标的办法。”

05. 推动尖端研究还必须提升周边领域的技术

要实现研究的快速化及高效化,除了研究方法和组织体制以外,用于实验的设备也是非常关键的。在森下先生的研究室,对于能够提高研究速度的设备,他都会在考量性价比的基础上积极推进设备投资。

基因治疗研究的难点,是查明基因进入体内后的作用机理。虽然在动物实验中能够明确这一问题,但在实际用于人体时,追踪这一系列作用过程是相当困难的。森下先生强调道:“要推进基因治疗的研究,决不能止步于基因相关的基础研究,必须全面提升细胞活动观察、数据分析技术等各类相关技术的水平。即便是在临床领域,也要在制药、诊断、追踪等所有方面寻求革新”。

“在思考今后的医疗时,首先要将元件与医药的融合作为重要的主题。同时,高分子医药品的重要性也会与日俱增。在我看来,要应对这种潮流采取前瞻性措施,依靠传统的研究方法是行不通的。而要将成果应用到临床领域,更是难上加难。以核酸医药的药剂支架为例,为了使其成为未来医疗的一大支柱,我们必须观察双链寡聚核苷酸在血管内部的融合程度。最好能找到可以在in vivo(人体内)环境下进行实时观察的技术。”

06. 帮助脑研究团队观察标本的BZ系列

在森下先生的研究室中,荧光显微镜和共焦显微镜对注入到生物体内的基因实施追踪观察的重要设备。根据实际用途区分使用这两种产品。

其中,基恩士的All-in-One荧光显微成像系统BZ系列自2008年2月导入以来,就成为了研究员们使用频率较高的产品。在小鼠末梢血管、心脏、脑等各类领域的细胞观察中大显身手。

图片:森下研究室引进的BZ系列……
森下研究室引进的BZ系列。据说使用频率非常高。
图片:用BZ系列拍摄的脑血管图像……
用BZ系列拍摄的脑血管图像。从图中可以观察到,氧化应激加剧时,血管会被染成红色。

隶属于临床基因治疗学脑研究团队的武田朱公先生表示,“自从我开始参与研究,我就只用荧光显微成像系统BZ系列”。目前他正在根据森下教授的研究成果,研究阿尔兹海默病的治疗及预防方法。这种疾病会导致神经细胞死亡,对此,武田先生表示“其实该病与血管存在很大的关联性,现已查明高血压等危险因子。我们正试图从此类因子上找到新的科研突破口”。

BZ系列的主要用途,就是观察实验小鼠的脑部血管。研究者不仅要提取阿尔兹海默病模型小鼠的脑部血管并放大观察,还要进行照片拍摄及测量。“可进行荧光、明视场观察,操作方法更是简明易懂,非常方便”。即使要观察几十个标本,也能用一小时左右完成包括照片拍摄在内的一系列工作。

武田先生的研究表明,脑部血管内的氧化应激一旦加剧,血液循环就会恶化。观察这种状态时,BZ系列能够发挥很大的作用。血管的厚度要大于组织切片,放大观察时很难对准焦点。利用快速全焦功能就能解决这一问题,将不同焦平面的信息叠加成为一张全幅对焦图像进行观察。而对于荧光观察中常见的荧光模糊现象,也能利用去霾处理功能轻松除去。

武田先生经常需要在实验中观察脑的整体情况。因此,他会在低倍率观察整体图像的同时活用的测量功能进行测量。

图片:武田先生
在研究阿尔兹海默病的治疗及预防时,武田朱公先生会采用BZ系列。2004年,荣获“第23届 高桑荣松奖”。

“老人斑是阿尔兹海默的临床表现,具有分布不均的特点,一张图片即可实现脑部整体的观察是一个巨大的优势。而且自动测量老人斑的数量及面积也能帮助我提高实验效率。目前我正在撰写论文,其中用到的照片也都是用BZ系列拍摄的。”

据武田先生所说,在查阅相同研究领域发表过的论文时,他发现只有一部分照片是清晰的,这或许是因为血管难以对焦的缘故。相比之下,用BZ系列拍摄的图像,无论血管粗细,都能清晰成像。

武田先生拍摄的照片也确实在美国的学会赢得了好评。据说阿尔兹海默病研究领域的权威专家也对这种清晰的照片产生了兴趣,提出“请务必将拍摄的标准操作方法发送给我”。时至今日,实验照片的画质已经具备了能够左右论文品质的重要性。

07. 在血管新生状况观察中大展拳脚

图片:真田先生
真田文博先生正在研究HGF与老化的关系。在观察血管的新生状况时,他选择使用BZ系列。

而隶属于森下研究室心血管研究团队的真田文博先生,则正在研究HGF与老化的关系。血管新生被认为与骨髓细胞分化出的血管内皮前体细胞(EPC)有关,研究发现,在一种名为血管紧张素Ⅱ的激素作用下,EPC会发生老化,无法继续发挥功能。而真田先生的研究内容,就是通过小鼠实验,证明HGF能够起到抑制老化的作用。

真田先生用绿色荧光小鼠及转基因小鼠进行实验,并用BZ系列拍摄骨髓细胞分化出的EPC逐步形成血管的过程。据他所说,“BZ系列能以低倍率观察腿部肌肉,可有效研究使用HGF后血管会发生何种程度的新生”。传统研究会使用共焦显微镜进行观察,而真田先生则表示,自从开始使用BZ系列,“从标本观察到照片拍摄的一系列操作速度都成倍加快,大幅提高了工作效率”。

图片:真田先生已经证明,HGF的抗氧化功能……
真田先生已经证明,HGF的抗氧化功能,能够抑制血管内皮前体细胞血管紧张素Ⅱ造成的老化,维持血管新生作用。
利用去霾处理功能,获取清晰的照片。清晰拍摄骨髓细胞和血管。
真田先生已经证明,HGF的抗氧化功能,能够抑制血管内皮前体细胞血管紧张素Ⅱ造成的老化,维持血管新生作用。
利用去霾处理功能,获取清晰的照片。清晰拍摄骨髓细胞和血管。
骨髓细胞分化的血管内皮前体细胞(EPC)生成血管的照片。
出现了荧光模糊。

去霾功能是软件中非常有效的功能“由于细胞会因激发光照射的点位不在同一层面而产生清晰度差异,这项功能是去除荧光模糊的必备功能。使用共焦显微镜时必须逐层对焦,费时费力,自从开始使用BZ系列,这项工作就变得轻松多了。”

观察活细胞时,还必须尽可能地维持无污染状态。对此,真田先生表扬道,“BZ系列不仅无需暗室还非常小巧,可以安装在研究室内,制成标本后马上就能开始观察,非常方便”。

此外,共焦显微镜如需清晰观察细胞状态,就必须使用油镜,在改换倍率时,标本反而会在油的影响下扭曲失真。真田先生指出“BZ系列基本不用借助油浸镜头,这也是它的一大优点”。

在开展EPC相关研究的同时,真田先生还在研究一种名为骨膜蛋白的与骨骼再生有关的蛋白质对血管造成的影响。在此过程中,他会进行癌细胞增殖抑制的相关实验,BZ系列的测量功能在癌细胞浸润范围的测量方面为他提供了许多帮助。

在森下先生的研究室中,除了武田先生所在的脑研究团队和真田先生所在的心血管研究团队外,还开展了分子治疗、肾脏/动脉硬化/核酸医药、骨/抗衰老、核酸医药等研究,积极通过产学合作,推动基因治疗的实用化研究。森下先生从体制层面布局基因治疗,以更加开阔的视野推进研究,希望借此早日为医疗事业做出贡献。

“希望通过研究,尽早拿出能够让广大患者受益的成果”,森下先生的这一理念已经成为了研究室所有成员的共识。所有团队都秉承着“第一时间尝试新想法”的理念,不遗余力地推动着研究速度提升及高效化的进程。

在这样一支研究员队伍中,BZ系列深受好评,不仅使用频率很高,还成为了各类划时代发现中不可或缺的见证者。通过放大观察的快速化、高效化,为基因治疗领域的先进研究提供支持。

(截至2008年10月)

<小知识> 基因治疗

对于因基因异常引发的先天性疾病等,通过将正常基因导入体内的方法,起到修复细胞、治疗疾病的效果。过去通常会使用运载体病毒来进行研究,目前学术界正在探讨如何用更加安全的质粒将基因导入到体内。近年来,针对生活习惯病等后天性疾病的应用研究也正在如火如荼的开展当中。