外泌体的定位观察

近年来,体内肿瘤细胞、免疫细胞等各类细胞分泌的细胞外囊泡(EV:extracellular vesicles)开始受到关注。细胞外囊泡存在于绝大多数的体液(血液、尿、髓液等)及细胞培养液中,是一种细胞分泌的小型(直径约30 nm至100 nm)囊泡。
根据不同的生成机制,细胞外囊泡可进一步细分为“外泌体(exosomes)”、“微泡(MV:microvesicles)”和“凋亡小体(apoptotic bodies)”。在过去的很长一段时间里,外泌体都被视为一种释放无用细胞内容物的囊泡。但是近年来,人们发现外泌体其实与恶性疾病、免疫疾病、神经疾病、传染病等各类疾病有着密切的关联,或许能够帮助人们查明病状,为治疗带来更多的可能性,这也使外泌体成为了备受关注的焦点。
下面我们将基于外泌体的生成机制、功能作用,以及相关的疾病治疗案例,从基础知识出发,介绍相关的观察事例。如果您对外泌体感兴趣,或是正在为观察分析方法感到困扰,希望下面的内容能够为您提供参考。

什么是外泌体

外泌体是细胞外囊泡的一种。细胞可利用一种名为“内吞作用(endocytosis)”的机制,将细胞外的物质转运到细胞内,生成名为“内体(endosome)”的囊泡。生成的囊泡将依次经历网格蛋白囊泡⇒初级内体⇒次级内体阶段。随后,含有大量腔内囊泡(ILV:intraluminal membrane vesicle)的多泡体(MVB:multivesicular body)会与细胞膜发生融合,将囊泡由内体释放到细胞外。这些被释放出来的囊泡,就是外泌体。
外泌体中含有各类蛋白质及核糖核酸(RNA:ribonucleic acid),这些成分源自各类分泌细胞,例如内体及细胞膜中的蛋白质、与细胞内运输相关的蛋白质等等。外泌体中还含有内体膜中的脂质和分泌细胞的细胞膜成分,这些内容物被称为“运输物(cargo)”。这种外泌体会被其他细胞吞食,外泌体内携带的蛋白质及RNA也会被传递到吞食外泌体的细胞中。
由此可见,外泌体在细胞间信息传递中发挥着重要的作用,尤其是在医疗领域,围绕外泌体的研究正在不断推进当中。

外泌体的检测与分析

外泌体的分析方法大致可分为2种。一种是从体液及细胞培养液中提取外泌体,对由外泌体运输的蛋白质、脂质及RNA进行分析的方法。另一种则是直接在体液中检测分析外泌体的方法。外泌体被细胞吞食及分泌的具体过程,需借助荧光显微成像系统进行观察及分析。

使用体液及细胞培养液的分析方法

通常情况下,要从血液、腹水等体液样本中分离提纯外泌体,会采用超离心、超过滤等方法。但是,用此类方法提取到的外泌体,会混入性状、浓度相近的其他粒子、高质量蛋白质等杂质,很难单独分析外泌体。
为了解决这一问题,有时也会配合使用亲和纯化*1技术。为了确认最终分离提纯所得的样本是否为外泌体,还会借助动态光散射法及显微镜,进行尺寸核实与蛋白质印迹*2

*1:亲和纯化(affinity purification)
利用能够与目标分子进行特异性可逆结合的分子(配体)反应,对目标分子、蛋白质或相应复合体实施分离提纯的方法。
*2:蛋白质印迹法(western blotting:WB)
一种用于了解蛋白质特性的基础实验方法,可用于测量在外泌体中表达的蛋白质。

直接通过体液进行检测、分析的方法

人们正在研究无需分离提纯外泌体,直接在体液中进行检测的方法,例如,常被用于癌症治疗领域的,“流式细胞光度术*3”、“微阵列分析”、“表面等离子共振”等等。除此以外,还有以大肠癌诊断为目的的ExoScreen法。
不同于利用内窥镜及穿刺针采集肿瘤组织的传统活检(biopsy),以血液等体液为样本,实施诊断及治疗效果预测的“液体活检(liquid biopsy)”,已经成为了一种备受期待的新兴早期发现技术。

*3:流式细胞光度术(flow cytometry)
利用以激光照射细胞及微粒时产生的散射光或荧光,对粒子特性进行评估的技术。能够同时对单种细胞(细胞、细菌等)的多项特征进行高速测量。适用于评估外泌体的蛋白质表达量及其进入细胞内部的情况。虽然难以进行定量分析及囊泡种类的区分,却是一种能够观察细胞内吞外泌体过程的极简便方法。

采用荧光显微成像系统的观察分析

外泌体的直径约为30 nm至150 nm,很难用光学显微镜观察。使用电子显微镜则要面临繁琐的制样操作、真空和电子束导致变质的问题,物性测量也并不常见。最关键的是,电子显微镜并非适用于所有设施。
而利用荧光显微成像系统观察外泌体,则能借助荧光标记实现外泌体的可视化,进行跟踪观察。可以用荧光色素对提取到的外泌体中所含的RNA(RNA运输物)或外泌体膜进行染色,实现可视化观察。
借助上述方法,可以对外泌体的经时分布变化,外泌体的细胞间信息传递过程(即细胞内吞外泌体的情况)进行监控。荧光显微成像系统能够进行其他方法难以实现的观察,例如观察外泌体变化及相应过程等,作为一项可实现更高精度分析的新技术而备受关注。

外泌体在疾病治疗领域的应用

随着外泌体功能的日益明了,在以癌症早期发现、阿尔兹海默病、帕金森氏病、脊髓小脑变性症、亨廷顿病、肌萎缩侧索硬化(ALS)等神经变性疾病治疗为代表的医学领域,将外泌体用于内分泌、循环系统的治疗法及诊断法研究正在如火如荼地开展当中。

癌症的早期发现

研究人员认为,外泌体可能与癌细胞的生存及恶性化、转移等存在关联。在癌症患者体内癌细胞释放的外泌体中,含有源于癌细胞的各类蛋白质,会激活癌细胞特有的细胞杀伤性T细胞。这是因为源于癌细胞的外泌体含有癌症基因。这也就意味着,通过观察癌症患者体内细胞释放的外泌体,就能实现癌症的早期检测。
作为一种着眼于外泌体细胞间信息传递性质的癌症诊断法,液体活检(liquid biopsy)是发现早期癌症的重要手段。在基于液体活检的癌症诊断中,外泌体内容物能够反映释放源细胞的特征,例如癌症相关基因发生变异的ctDNA(circulating tumor DNA),因此通过调查异常细胞的外泌体,或许能够实现癌症的早期发现。

阿尔兹海默病的治疗

阿尔兹海默病是一种因β-淀粉样蛋白毒性损伤致使神经细胞死亡,引起脑部萎缩后发生的痴呆症。在阿尔兹海默病的治疗中,外泌体会对作为病因物质的β-淀粉样蛋白及Tau蛋白*4的增减造成较大的影响。
除此以外,为了更加安全地将医药品高效输送(delivery)至特定的患病组织及细胞,研究者们正在尝试在“药物传递系统(DDS:drug delivery system)”中,将药剂、核酸等封入外泌体,实现精准给药。

*4:Tau蛋白(tau protein)
Tau蛋白是一种存在于中枢及末梢神经系统神经细胞中的蛋白质。它会与多种蛋白质结合,参与发生在脑神经系统中的各类现象,例如脑部的后天发育、成体的神经发生等等。这种Tau蛋白的异常,或许就是阿尔兹海默病等神经变性疾病的发病原因。

液体活检诊断

液体活检(liquid biopsy)就是利用对身体负担较小的体液(体液、血液、尿液等低侵袭性液态样本)进行活检的技术,主要在癌症诊断领域发挥作用。
液体活检的样本中含有源自肿瘤及各类组织、细胞的信息,观察这些样本,可以全面掌握全身的肿瘤状况。
利用内窥镜及穿刺针采集样本的活检技术,不仅会给病人带来痛苦与风险,还只能采集极少部分的肿瘤组织,检测到不连贯的轮廓信息。
液体活检光用体液就能完成检测,可以在不对人体造成负担的前提下,开展癌症基因诊断及治疗效果预测。

什么是药物传递系统(DDS:drug delivery system)

药物传递系统是一种利用外泌体细胞间物质转运特性的治疗方法,可以将物质(蛋白质、核酸、脂质)运输到特定的细胞中。
这种疗法面世至今,已经成功验证了其对乳腺癌细胞的抗癌作用,并且曾通过将药物导入神经母细胞瘤细胞,成功减少了阿尔兹海默病诱发物质——β-淀粉样蛋白的量。
作为一种采用生物分子的疗法,外泌体DDS疗法与传统的纳米微粒药物运输疗法相比,毒性更低。人们在研究中还发现,外泌体DDS能够到达传统疗法难以穿透的组织深处,因此外泌体作为一种强有效的运输分子,正在受到越来越多的关注。

外泌体研究的展望

正如上文所说,随着医学及观察技术的发展,“传递细胞信息=导致病灶转移”这一外泌体的负面特性摇身一变,成为了在疾病预防、早期治疗、细胞直接靶向投药等领域开辟先进疗法的王牌,并因此备受关注。
其实,蔬菜瓜果等植物的细胞同样会分泌外泌体。以生姜为例,生姜具有抑制酒精性肝病的效果,这或许是因为生姜释放的外泌体具有一定的护肝作用,可避免肝脏受损。还有研究报告指出,白煮蛋的外泌体具有抑制动脉硬化,增强记忆力的效果。
东方医学认为膳食乃医疗之根本,治疗疾病的药物与促进健康的食物,原本就是同根同源的存在。从这一观点来看,围绕外泌体的研究给医疗和食品带来了更多的可能性,堪称是现代版的“药食同源”。

用简单操作确认三维定位

外泌体的直径约为30 nm至150 nm。因此,使用普通荧光显微镜很难对焦,给观察定位带来了不小的困难。而使用流式细胞分析仪(利用以激光照射细胞及微粒时产生的散射光或荧光,对粒子特性进行评估的仪器)进行分析,则无法确认定位及经时变化。
All-in-One荧光显微成像系统BZ-X800使用基于“电气投影元件”的结构化照明(Structured Illumination),运用独有的光学切片技术,呈现超越过往的清晰图像。定位及经时变化都能清晰呈现。
在下列示例中,研究者利用BZ-X800的切片功能,对人类表皮细胞中外泌体进行了定位观察。
BZ-X800能够借助高精细图像,观察某个细胞释放的外泌体,移动进入其他细胞内部的过程。

绿色:外泌体、红色:细胞膜
XYZ切片拍摄
接物透镜:PlanApo 100x
外泌体:绿色(PKH67)、细胞膜:红色(CellMaskTM Orange)、细胞核:蓝色(DAPI)

如果引进All-in-One荧光显微成像系统BZ-X800