活细胞成像 失败原因与成功诀窍
近年来，致力于活细胞成像（Live Cell Imaging *又被称为活细胞成像、延时拍摄成像）的研究人员不断增加。因为这种方式无需固定细胞，可观察细胞原始结构变化。但是，以活细胞为对象的观察难度高，会耗费很长的观察时间，经常会有研究者因此失败。
为此，我们特意面向备受活细胞成像失败困扰及今后要开展相关实验的人士，汇总了常见的3大失败事例及其对策，现介绍如下。
活细胞成像的失败事例1：细胞衰弱
在活细胞成像期间或结束后查看细胞的情况，经常会发现细胞从中途开始衰弱、细胞死亡、细胞变为意想不到的状态等现象。导致这些现象的原因可分为以下几种。
【原因1】光毒性对细胞造成了损伤
荧光观察时，激发光的波长越短或光照越强，对细胞造成的损伤也就越大。这就是所谓的“光毒性*1”，不仅会导致细胞因受损而衰弱、死亡，还有可能会造成出乎意料的影响。
对策
- 请尽可能使用灵敏度高的相机
- 请并用增益*2 、Binning*3 等设定，即使较弱的荧光也能感知
- 请尽量调弱激发光
- 进行拍摄设定时也请尽量避免照射激发光
- 请尽可能减少要拍摄的张数
- 不进行拍摄时请切断激发光
- *1：光毒性：通常指照射的光造成的损伤，但是在荧光观察时，指细胞产生的活性氧使周围的细胞遭受损伤。
- *2：增益：对相机接收的信号进行放大。放大程度越高（调高增益），显示的画面越明亮。虽然像素数不会变，但是会产生噪点。
- *3：Binning：虚拟地结合周围的像素，放大单位像素接收的光信号的功能。噪点较调高增益时更少，但是像素数会减少。
【原因2】没有稳定供给合适的环境
多数细胞都喜欢与生物体内相同的环境。以人类细胞为例，在培养室及培养用恒温箱中，基本上都需要满足温度37℃、二氧化碳浓度5%、湿度95%以上的条件。如果没有稳定供给这一条件，细胞就会衰弱，很难获得准确数据。
对策
- 请使用可以稳定提供适合环境（温度、二氧化碳浓度、湿度）的培养室及恒温箱
- 在室温变化大的季节，请使用空调等保持室温稳定
- 请避免空调等的风直接吹到样品。
- 使用多孔培养板时，请使用水分不会蒸发的型号
【原因3】菌、污染造成的影响
有的细胞容易受容器上附着的菌、污染物的影响。此外，移液管等实验用器械可能也会导致支原体污染*4、交叉培养污染 *5。
- 对策
-
- 实验时，请确保使用的容器、移液管等周边用品设备均为无菌状态
- 请尽量避免携带细胞移动
- *4：支原体污染：由支原体引起的感染。在细胞株被污染的众多原因中，是极为普遍的现象之一。
- *5：交叉培养污染：正在操作中的细胞混入其他细胞。多为器械原因混入。
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活细胞成像的失败事例2：焦点模糊
耗时许久的实验终于结束，一看得到的数据，却发现焦点从中途就模糊了。这种现象是较多的失败事例之一。许多研究者都经历过这种失败，但只要理解其中的原因，其实是可以主动避免的。
【原因1】温度漂移*7导致细胞移动，设定出错
如果在接通装置电源后马上进行拍摄设定，焦点在设定期间可能就会发生偏移。这是因为接通电源后的一段时间内，容器内的培养液会发生对流，细胞也会移动。观察设备等也会因温度变化而出现一定的膨胀现象，使焦点发生偏移。在观察漂浮细胞、粘附细胞时，都需要注意拍摄设定中与拍摄中的温度偏差。
- 对策
-
- 请在放置细胞前用空容器暖机运行30分钟，
- 暖机运行后放置细胞，在设定焦点等之前还要等待30至60分钟
- *7：温度漂移：温度变化导致漂浮的细胞运动的现象、因装置自身的膨胀使对焦位置错开的现象。
【原因2】分裂时细胞运动
活着的细胞在分裂时尤其会朝上下方向（Z方向）运动。因此，如果在分裂的瞬间用高倍率进行单次自动对焦拍摄，焦点会发生偏移。
对策
- 请使用景深*8大的低倍镜头
- 如果是高倍率，请使用自动对焦功能或Z栈功能
在活细胞成像中采取上述预防措施，可切实防止焦点偏移。此时，为了尽量缩短照射激发光的时间，尽量缩小自动对焦及Z栈的设定范围*9也是非常关键的。
- *8：景深：表示对焦的范围。一般NA越高景深越浅。
- *9：Z栈的设定范围：Z栈是对不同的Z位置数据进行多张拍摄的功能。拍摄范围越大移动步径越小，可获得的信息越多，但是细胞的损伤也相应地增加，因此希望以尽可能少的张数进行设定。
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活细胞成像的失败事例3：细胞逃离视野
实验后观看数据时，有时会发现细胞已经中途移到了视野范围外。要是细胞在目标现象尚未完成时发生了移动，就只能重做实验。
【原因】细胞动了
实验时间越长，细胞逃离视野范围的可能性越高。只要细胞是活着的，就无法避免这一问题。相信大家都在各类论文中读到过观察细胞细节的数据。其中的绝大多数，都是通过高倍率反复进行多次拍摄后获得的结果，需要耗费大量的时间和精力。
要切实避免失败，较好的方法就是一次性拍摄多点，或者是让视野追随移动的细胞进行拍摄。
对策
- 请用倍率低的镜头拍摄大的视野
- 请一次拍摄多个部位
低倍率观察时视野较大，细胞不易逃离视野，可切实捕捉细胞。但使用低倍率，却无法观察细胞的细节。曝光时间也会变长，如观察对象在拍摄期间运动，图像也可能会发生抖动*10，故请注意。
- *10：曝光时间和图像抖动：调弱激发光，曝光时间自然变长。如果在打开快门期间细胞动了，图像就会抖动。要防止这种现象，使用高灵敏度的相机是一种有效的办法。
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使活细胞成像实验效率大幅提升的方法
一直以来，要获得更好的研究成果，就必须重复进行更多次的实验，获取更多的信息。但是活细胞成像实验的单次耗时很长，多次重复会耗费大量的时间。特别理想的状态，就是能够在单次实验中获取尽可能多的信息。
基恩士的一体化荧光显微成像系统“BZ-X800系列”，能够解决活细胞成像“单次实验可获得的信息量”问题。可一次性获取2倍、4倍、20倍等不同条件下最多999个点的数据。设定操作也很简单，可缩短过去用于系统准备及使用者培训的时间。
